Método de coloração de GRAM

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. (Veja mais)

Objetivos

a- Aprender a preparar esfregaço de bactérias;

b- Realizar a técnica de Coloração de Gram;

c- Aprender o fundamento do método de coloração de Gram;

d- Comparar a estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

e- Permitir a observação da morfologia bacteriana e fornecer informações a respeito do comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram.

Interpretação

O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.

Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.

Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitando a extração do complexo CV-l.

Procedimentos:

a- Preparar esfregaços a partir de culturas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Serratia marcescens.

b- Corar os esfregaços pelo método de coloração de Gram.

c- Observar ao microscópio óptico, sob imersão e identificar a morfologia deste microrganismos e sua reação frente ao método de Gram.

Preparo do esfregaço:

a- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;

b- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço; 

c- Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar e colocar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica;

d- Flambar a agulha bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa com a cultura teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra, 

e- Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

f- Deixar secar nas proximidades da chama;

g- Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente).

Método de Coloração de Gram:

• Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;
• Lavar rapidamente em água destilada;
• Cobrir a lâmina com solução de Iugol (mordente) por um minuto;
• Lavar em água destilada;
• Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona ou álcool absoluto (cerca de 15 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
• Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
• Lavar a lâmina em água destilada e secar (sem esfregar);
• Colocar uma gota de óleo de cedro sobre a lâmina e observar em objetiva de imersão (IOOX).

RESULTADO: 

• bactérias Gram-positivas: roxo
• bactérias Gram-negativas: rosa/vermelho

Observações:

O descoramento para mais ou para menos é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool-acetona.

A idade da cultura bacteriana tem Importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células. Gram-positivas freqüentemente se tomam Gram-negativas.

Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da Gram-negatividade da cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como Gram-positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gram-negativas, tal como Escherichia coli, como controles.

  

Resumo

Soluções em ordem de aplicação	Reação do aspecto das bactérias  Gram-positivas	Reação do aspecto das bactérias  Gram-negativas
Cristal violeta	Coradas em violeta	Coradas em violeta
Solução de Iugol	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
Álcool-acetona	Desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade; o complexo CV-I não pode sair da célula, que   permanece violeta	Extração dos lipídeos da parede celular, aumento da porosidade; o complexo CV-I é removido da célula
Fucsina ou safranina	A célula não é afetada, permanece violeta	A célula adquire o corante, tornando-se vermelha

           

Bibliografia

• Material retirado de: http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm 07/08/2014 às 19:15hs. 
• http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=19