Método de coloração de GRAM

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. (Veja mais)

Objetivos

a- Aprender a preparar esfregaço de bactérias;

b- Realizar a técnica de Coloração de Gram;

c- Aprender o fundamento do método de coloração de Gram;

d- Comparar a estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

e- Permitir a observação da morfologia bacteriana e fornecer informações a respeito do comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram.

Interpretação

O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.

Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.

Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitando a extração do complexo CV-l.

Procedimentos:

a- Preparar esfregaços a partir de culturas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Serratia marcescens.

b- Corar os esfregaços pelo método de coloração de Gram.

c- Observar ao microscópio óptico, sob imersão e identificar a morfologia deste microrganismos e sua reação frente ao método de Gram.

Preparo do esfregaço:

a- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;

b- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço; 

c- Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar e colocar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica;

d- Flambar a agulha bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa com a cultura teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra, 

e- Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

f- Deixar secar nas proximidades da chama;

g- Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente).

Método de Coloração de Gram:

• Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;
• Lavar rapidamente em água destilada;
• Cobrir a lâmina com solução de Iugol (mordente) por um minuto;
• Lavar em água destilada;
• Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona ou álcool absoluto (cerca de 15 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
• Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
• Lavar a lâmina em água destilada e secar (sem esfregar);
• Colocar uma gota de óleo de cedro sobre a lâmina e observar em objetiva de imersão (IOOX).

RESULTADO: 

• bactérias Gram-positivas: roxo
• bactérias Gram-negativas: rosa/vermelho

Observações:

O descoramento para mais ou para menos é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool-acetona.

A idade da cultura bacteriana tem Importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células. Gram-positivas freqüentemente se tomam Gram-negativas.

Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da Gram-negatividade da cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como Gram-positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gram-negativas, tal como Escherichia coli, como controles.

  

Resumo

Soluções em ordem de aplicação	Reação do aspecto das bactérias  Gram-positivas	Reação do aspecto das bactérias  Gram-negativas
Cristal violeta	Coradas em violeta	Coradas em violeta
Solução de Iugol	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta	Formação do complexo CV-I no interior da célula, que permanece violeta
Álcool-acetona	Desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade; o complexo CV-I não pode sair da célula, que   permanece violeta	Extração dos lipídeos da parede celular, aumento da porosidade; o complexo CV-I é removido da célula
Fucsina ou safranina	A célula não é afetada, permanece violeta	A célula adquire o corante, tornando-se vermelha

           

Bibliografia

• Material retirado de: http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm 07/08/2014 às 19:15hs. 
• http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=19 

HPLC ou CLAE

oi

HPLC resumo by Ferreira Patricia

Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação. O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

A separação é por migração da amostra através de uma fase estacionária por intermédio de um fluido (fase móvel).

Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase estacionária.O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cada componente migra através do sistema.

História e Significado

O nome Cromatografia (χρωματογραφία) é de origem grega:

• χρώμα: chroma, cor;
• γραφειν: grafein, grafia.

No início do século XX, o Botânico russo M.S. Tsver encontrou  uma maneira de separar os vários pigmentos de flores e folhas. Ele moeu as plantas e dissolveu os pigmentos e, então, despejou a solução no topo de um tubo vertical cheio de giz moído. os diferentes pigmentos percorreram a coluna de giz em diferentes velocidades, produzindo bandas coloridas no tubo e inspirando o nome cromatografia (escrita em cores). A separação ocorreu porque o giz absorveu os diferentes pigmentos em diferentes graus.

Cromatografia em Coluna Aberta
Experimento de Tswett

Princípio Básico

• A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel (líquida ou gás) e com a fase estacionária (líquida ou sólida);
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade;
• A fase estacionária é a força resistiva e a fase móvel é a força propulsiva.
• A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias;
• A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.

Classificação

A classificação da cromatografia é de acordo com:

• O objetivo (analítica ou preparativa)
• O sistema cromatográfico (em coluna ou planar);
• A Fase Móvel (líquido, gás ou gás pressurizado: com composição constante ou variável);
• A Fase Estacionária (líquida, sólida ou quimicamente ligada);
• O modo de separação (adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou afinidade);
• O modo de operação (frontal, deslocamento ou eluição).

Aplicação

A cromatografia desempenha um papel importante em diversas áreas, como a química orgânica, bioquímica, química inorgânica, química ambiental e a química alimentícia. Utilizada em Investigação criminal, industria química, farmacêutica, do petróleo e de alimentos, entre outras, para:

• Quantificação das impurezas de um produto;
• Determinação da composição e da formulação de um produto;
• Controle de qualidade de ativos e formas farmacêuticas;
• Outros.

Fonte

• Princípios de Química: Questionando A Vida Moderna e o Meio Ambiente/ Peter Atkins, Loretta Jones. - 5 ª Ed. - Porto Alegre: Bookman, 2012.
• http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf
• http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?Itemid=451&id=103&option=com_content&task=view
• http://cromatografialiquida.com.br/Clae/colunaaberta.htm

Método de contagem de placas

Aula prática de Análise Farmacêutica 2

Para garantir a qualidade dos produtos farmacêuticos é necessário ter um controle rigoroso da produção dos mesmos.

O método utilizado nessa prática foi o Método de contagem em placa. O método consiste em fazer uma diluição seriada e plaquear uma alíquota de cada diluição pelo método de espalhamento em placa. O limite de crescimento microbiológico é de 30 a 300 colônias por placa.

Para se ter um resultado fidedigno, é necessário esterilizar os materiais a ser utilizados nessa técnica.

A manipulação foi feita por trás da chama do bico de bunsen, de forma a garantir o estabelecimento de uma zona de esterilidade. É somente nesta zona estéril que os tubos ou recipientes com meios de cultura estéreis e o material a ser inoculado, foram ser abertos ou manipulados, para ser preservada a sua esterilidade.

A boca dos tubos de ensaio foi flambada imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão).

OBJETIVO

Determinar o número de microrganismos presente na suspensão através dos métodos de contagem em placa.

MATERIAIS, REAGENTES E EQUIPAMENTOS

· Alça de inoculação;

· Algodão;

· Balança analítica;

· Bico de Bunsen;

· Caldo caseína-soja;

· Espátula;

· Estante;

· Estufa;

· Fita crepe;

· Marcador permanente;

· Micropipeta calibrada;

· Placas de Petri com meios de cultura;

· Ponteiras calibradas;

· Solução salina

· Solução tampão fosfato;

· Talco em quantidade suficiente para duplicata e triplicata;

· Tubos de diluição;

· Vidro de relógio.

  

Observação:

· Realizar testes de esterilidade nos equipamentos e materiais antes de iniciar a amostragem.

· Calibrar os equipamentos.

PROCEDIMENTO

Preparo da amostra:

1. Pesou-se 1g de talco na balança analítica, com o auxílio de espátula e vidro de relógio

2. Mediu-se 9ml de solução tampão;

3. Colocou-se no Becker a solução tampão e o talco e homogeneizou.

Etapas do ensaio

4. Colocou-se 4 tubos identificados na estante, com 9ml de caldo caseína-soja cada.

5. Com o auxílio da micropipeta e ponteira:

- Retirou-se 1ml da solução inicial contida no Becker e colocou-se no 1º tubo.

- Retirou-se 1ml do 1º tubo e colocou-se no 2º tubo.

- Retirou-se 1ml do 2º tubo e colocou-se no 3º tubo.

- Retirou-se 1ml do 3º tubo e colocou-se no 4º tubo.

6. Tamparam-se todos os tubos com algodão.

7. Identificou-se as tampas da placa de petri, 2 placas para cada tubo: 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 4.1, 4.2;

8. Com o bico de Bunsem ligado:

- Colocou-se a ponteira na micropipeta;

- Retirou-se 1ml do 1º tubo e impregnou-se a placa 1.1.

- Flambou-se a boca do recipiente o terminar a inoculação e tampou-se

- Flambou-se a alça de inoculação (a) e fez-se a semeadura por esgotamento(b);

- Tampou-se a placa.

 

9. Procedeu-se da mesma forma com todos os tubos e placas.

10. Reuniram-se todas as placas de petri, envolveu-se com fita crepe e levou-se à estufa por 7 dias.

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

Após 7 dias na estufa, retirou-se as placas de petri semeadas e colocaram-se na bancada por ordem de semeadura.

Verificou-se que a amostragem e a duplicata não estavam equivalentes, impossibilitando a contagem fidedigna de colônias.

RESULTADO

O resultado foi inconclusivo devido às duplicadas não serem equivalentes. Suspeita-se que houve erro técnico às ponteiras e pipetas não estarem calibradas.

TERMOS E DEFINIÇÕES

· Esterilização: processo de destruição completa ou remoção de microrganismos viáveis.

· UFC: Unidade Formadora de Colônias

· Plaquear: Colocar células e bactérias sobre um meio semissólido de cultura com o objetivo de cultivá-las.

· Equivalentes: Que tem o mesmo valor.

· Inconclusivo: Não possui conclusão.

· Teste de esterilidade: é a demonstração de que um produto é estéril por meio da realização de um ensaio microbiológico em uma amostra de determinado lote.

· Flambar: sinônimo de incendiar.

  

BIBLIOGRAFIA

• http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42 (acessado dia 06/10/2013)
• http://biologia.ifsc.usp.br/micro/outros/Pr%E1tico-te%F3rico.pdf (acessado dia 06/10/2013)
• http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/789e06004745814c8d77dd3fbc4c6735/CP+N%C2%BA+25+-+M%C3%A9todos.pdf?MOD=AJPERES (acessado dia 06/10/2013)

Reações de Oxidação-redução (Redox)

A oxidação é um processo no qual uma substância química perde um ou mais elétrons, tornando-se “oxidada”. A redução é um processo no qual uma substância química ganha um ou mais elétrons, tornando-se “reduzida”. A oxidação deve sempre ocorrer quando há redução e a redução está sempre presente durante a oxidação e, por isso, uma reação que envolve ambos os processos é chamado de reação de oxidação-redução (ou reação redox). As reações de oxidação-redução também são conhecidas como reações eletroquímicas, que podem ser definidas como reações que envolvem a troca de elétrons entre as substâncias químicas. O campo de estudo das reações eletroquímicas e suas aplicações é denominada eletroquímica.

Equação geral

Oxidação: Red¹ → Ox¹ + ne- 

Redução: Ox + ne- → Red 

Reação Global: Ox + Red¹→ Red + Ox¹ 

Ox: sofre redução 

Ox¹: forma oxidada de Red¹.

Red¹: se oxida enquanto n elétrons são transferidos de Red¹ para Ox. 

Red: forma reduzida de Ox.

Exemplo 1

Oxidação: 2Fe   →  2Fe² + 4e-

Redução: O2 + 4H + + 4e-  → 2H2O

Reação global: 2Fe + O2 + 4H + → 2Fe2 + 2H2O

  

Exemplo 2

 

Exemplo 3

Equação geral: 

• A semi-equação de oxidação é: 
• A semi-equação de redução é: 

• O é a espécie que perde elétrons (oxidou), é o agente redutor.
• O  é a espécie que ganha elétrons (reduziu), é o agente oxidante.

Os pares redox conjugados são e .

Fonte:

• Vogel, A. Química Analítica Qualitativa. 5ª edição. Mestre Jou, 1981.
• http://profs.ccems.pt/PauloPortugal/CFQ/redox/redox.htm

Erros Experimentais (Analíticos)

Toda medida possui alguma incerteza, que é chamada de erro experimental. As Conclusões podem ser expressas com um alto ou baixo grau de confiança, mais nunca com completa certeza. O erro experimental é classificado como sistemático ou aleatório.

Sistemático: também chamado de erro determinado, é um erro reprodutível que pode ser detectado e corrigido. Surge devido a uma falha de um equipamento ou na falha no projeto de um equipamento. Se realizarmos o experimento novamente, exatamente da mesma maneira, o erro é reprodutível.

Aleatório: também chamado de erro indeterminado, não pode ser eliminado, mas pode ser diminuído em um experimento realizado de forma mais adequada. Resulta dos efeitos de variáveis que não estão controladas nas medidas. A probabilidade de o erro aleatório ser positivo ou negativo é a mesma.

Mesmo químicos analíticos experientes podem cometer falhas primárias na escolha e execução de um método analítico. 

Falhas que comprometem os resultados experimentais:

• Amostragem estatisticamente não representativa; 
• Inadequação de procedimentos de limpeza de materiais e acessórios analíticos; 
• Escolha errada do grau de pureza dos reagentes; 
• Escolha inadequada do método analítico.

Veja também outros erros analíticos: Algarismos Significativos e o Precisão e Exatidão

Fonte

• Análise Química Quantitativa. Harris, Daniel C. 7ª ed. Rio de Janeiro: LTC, 2011. 

Algarismos significativos

No valor que expressa a magnitude de uma grande za através de uma unidade de medida, os algarismos conhecidos com certeza mais o algarismo duvidoso são denominados de algarismos significativos. Por exemplo, se ao medir o volume de uma amostra líquida numa proveta de 25 mL, cuja menor divisão é 0,1mL, encontrou-se o valor 17,24 mL, este resultado tem quatro algarismos significativos (os dígitos um, sete e dois são conhecidos com certeza e o quatro é o algarismo duvidoso – aquele que foi estimado).

O algarismo duvidoso sempre está na casa decimal em que está o limite do erro do aparelho de medida utilizado. Como o limite de erro de uma proveta corresponde à metade de sua menor divisão, no caso da proveta acima mencionada, este limite é de 0,05 mL; por isto que no valor 17,24 mL o dígito 4 corresponde ao algarismo duvidoso. Já no caso de um valor de massa igual a 7,241 g, medido numa balança cujo fundo de escala é 0,001g (para balanças, o limite de erro é igual à menor divisão), os dígitos sete, dois, e quatro são conhecidos com certeza e o um é o algarismos duvidoso.

Se à esquerda de um número só houver zeros, estes zeros não são algarismos significativos.
Nos números que não têm vírgula decimal, os zeros podem ser ou não significativos. Para eliminar possíveis confusões, vamos adotar a convenção de incluir uma vírgula decimal se os zeros forem significativos. Assim, 100, tem três algarismos significativos, enquanto 100 só tem um. Ou então, escreve-se em notação científica 1,00 × 10² (com três algarismos significativos) ou 1 × 10² (com um algarismo significativo).

Algarismos significativos e massas atômicas: Ao observar uma boa tabela periódica, verificamos que as massas atômicas de alguns elementos têm mais algarismos significativos do que outros. Ao usarmos massas atômicas em cálculos, adotaremos a seguinte convenção: usar-se-á para a massa atômica um algarismo significativo a mais do que o número de algarismos de qualquer outro dado.

Fonte

• http://www3.fsa.br/fabricio/algarismos_significativos.htm 
• http://matefisica.blogs.sapo.pt/340.html 
• http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAauMAB/arredondamento

Precisão e Exatidão

Refere-se a todo procedimento em que se mede o volume de um reagente, que é usado para reagir com um analito. Em alguns casos estes termos possuem o mesmo significado, mas no trabalho de análise química são diferentes e precisam estar acompanhados um do outro. Um método, ou uma análise que não contenha erros sistemáticos é dita exata, isto é, seus resultados refletem perfeitamente o valor real do componente em estudo. Mas para que esta análise seja considerada precisa, é necessário que haja uma repetibilidade de seus resultados. Então, uma análise ou um método será exato e preciso quando seus resultados forem corretos e se repetirem, confirmando a realidade de seus dados.

Precisão: 

É uma medida da reprodutibilidade de um resultado. É o grau de variação das medidas que você faz. Ou seja, se você tirar 10 medidas com cada um de dois equipamentos diferentes, o que apresentar menos medidas diferentes é o que terá maior precisão. Ex. se uma grandeza for medida várias vezes e os valores forem muito próximos uns dos outros, a medida é precisa. 

Exatidão: 

Se refere a quão próximo um valor de uma medida está do “valor real”. 

É quando a medida se aproxima da realidade, ou seja, a parte que é constante no erro. Por exemplo, se você tem uma diferença de 2 milímetros em uma régua, com relação ao valor exato, você terá um erro sistemático de 2 milímetros em todas as medidas (desvio máximo do valor exato). Esse valor fornece a exatidão da régua.

Um dado constituinte em um mesmo material é determinado por três métodos diferentes, (a), (b), e (c), onde foram feitas 5 medidas em cada método.

Exemplo: 

• Você tem que pesar 1g de uma substância, mas ao colocar na balança o produto, você pesou 0,999g. Esse valor foi preciso mas não exato.

• Ao pesar uma massa de 1 kg, toda vez que for pesada poderá dar um resultado igual a 985g até 1005g, ou seja, ela terá uma precisão 99,5 %.

Resumindo: precisão é a capacidade da balança em fornecer resultados reprodutíveis, mesmo que não sejam corretos e; exatidão é a capacidade que a balança tem de fornecer resultados corretos. Uma boa balança, ou qualquer outro instrumento de medição,  deve ser precisa e exata.

Fonte

• Análise Química Quantitativa. Harris, Daniel C. 7ª ed. Rio de Janeiro: LTC, 2011. 
• http://www.infoescola.com/quimica/precisao-e-exatidao-na-quimica-analitica/ 
• https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:zmuzUQIsg-oJ:www.cpact.embrapa.br/eventos/2010/met/palestras/26/261010_PALESTRA3_ADRIANE_NUNES.pdf+&hl=pt&gl=br&pid=bl&srcid=ADGEESjiIcJIFi2b_eDVcqPjOxCh4cyRNZzeBDiU-Jc8KWTYkZ3xKgtaeK6md3eVZWBH8OQMWFLT9VKKjm_kj1N5IJOK2JJz5MeQsMU2zxfAp4LGetJK9jbxyADVqgMF24Zp5qOdKnvn&sig=AHIEtbTySIVoMfKsdYqIC1d_-Nc6U754Qg

Lei de Beer-Lambert-Bouguer

Quando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi enunciada a seguinte lei:

" A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ".  

Esta lei foi descoberta pela primeira vez em 1729 pelo matemático, geofísico e astrônomo francês Pierre Bouguer (1698-1758). A sua autoria é, contudo, freqüentemente atribuída de forma errada ao matemático, físico e astrônomo francês Johann Lambert (1728-1777). No seu trabalho em 1760, Lambert citou a descoberta de Bouguer e constatou que a fração de luz que é absorvida por uma amostra é independente da potência radiante incidente (P_λ^o). Este fato é conhecido como Lei de Lambert, embora, na realidade, só seja verdadeira se P_λ^o for pequeno e se a extensão de outros fenômenos como a dispersão da luz ou reações fotoquímicas for desprezável. 

Só 92 anos depois é que a lei foi modificada de forma a incluir a concentração da solução na fórmula de cálculo. Essa modificação foi da autoria do físico e matemático alemão August Beer (1825-1863). Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela encontra, isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente ".

 

A lei de Beer-Lambert, também conhecida como lei de Beer ou lei de Beer-Lambert-Bouguer é uma relação empírica que, na Óptica, relaciona a absorção de luz com as propriedades do material atravessado por esta. Isto se pode expressar de distintas maneiras:

Onde:

• A é a absorbância (ou absorvância)
• I₀ é a intensidade da luz incidente
• I₁ é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio
• l é a distância que a luz atravessa pelo corpo
• c é a concentração de sustância absorvente no meio
• α é o coeficiente de absorção ou a absortividade molar da substância
• λ é o comprimento de onda do feixe de luz 
• k é o coeficiente de extinção





Esquema da diminuição da potência radiante de uma radiação monocromática após atravessar uma cuvette de largura l contendo a solução com uma concentração c no componente em estudo e uma coeficiente de absorção molar característica ε.

Em resumo, a lei explica que há uma relação exponencial entre a transmissão de luz através de uma substância e a concentração da substância, assim como também entre a transmissão e a longitude do corpo que a luz atravessa. Se conhecemos l e α, a concentração da substância pode ser deduzida a partir da quantidade de luz transmitida.

As unidades de c e α dependem do modo em que se expresse a concentração da sustância absorvente. Se a sustância é líquida, se deve expressar como uma fração molar. As unidades de α são o inverso do comprimento (por exemplo cm⁻¹). No caso dos gases, c pode ser expressada como densidade (a longitude ao cubo, por exemplo cm⁻³), em cujo caso α é uma seção representativa da absorção e tem as unidades em comprimento ao quadrado (cm², por exemplo). Se a concentração de c está expressa em moles por volume, α é a absorvância molar normalmente dada em mol cm⁻². No entanto, também pode-se tratar de uma suspensão e aí a unidade de concentração é expressa em FTU.

O valor do coeficiente de absorção α varia segundo os materiais absorventes e com o comprimento de onda para cada material em particular. Deve ser determinado experimentalmente.

A lei tende a não ser válida para concentrações muito elevadas, especialmente se o material dispersa muito a luz.

A relação da lei entre concentração e absorção de luz é a base do uso de espectroscopia para determinar a concentração de substâncias em química analítica.

Para a correta utilização e aplicação da lei de Lambert-Beer, é necessário que estejam reunidos alguns pré-requisitos, nomeadamente:

• As partículas (átomos, moléculas ou iões) presentes em solução devem absorver a luz de forma independente entre si; 

• O meio absorvente deve ser homogêneo (solução) e não dispersar a radiação;

• A radiação incidente deve estar colimada (raios paralelos entre si) e deve atravessar a mesma distância durante a qual interage com as partículas existentes em solução;

• A radiação deve ser monocromática, isto é, ser composta por apenas um comprimento de onda selecionado (normalmente, correspondente ao comprimento de onda para o qual a absorvância da espécie em estudo é máxima);

• O fluxo da radiação incidente não pode induzir processos que impliquem a desestabilização dos átomos, moléculas ou iões, como por exemplo excitação eletrônica que dê origem a fenômenos de fluorescência ou fosforescência.

 Resolva as questões:

1. Qual a concentração de MnO 4 -1 em mol L-1 de uma solução com absorbância de 0,345 à 500nm utilizando uma cubeta de 1cm? A absortividade molar a 500nm é 10.000 mol-1 Lcm-1.
2. Se a absorbância de uma solução padrão de CuSO4 com concentração de 0,00025 mol L-1 foi 0,150 à 540 nm utilizando-se uma cubeta de 2 cm, qual a absortividade molar da substância neste comprimento de onda?

Fonte:

• http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/conceito.html
• http://pt.wikipedia.org/wiki/Lei_de_Beer-Lambert
• http://wikiciencias.casadasciencias.org/index.php/Lei_de_Lambert%E2%80%93Beer

Espectrofotômetro

Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros, como é verificado a seguir. A luz, habitualmente fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma ou rede de difração (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes monocromáticas). O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal elétrico amplificado e visualizado no galvanômetro em números, é lido como uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvene existente na cubeta. A precisão dos comprimentos de onda para análise são chamados de bandas de passagem, mais comum na ordem de 10nm. O espectro da análise mais comum é de 330nm a 1100nm para a faixa visível.

Antes de utilizar um espectrofotômetro sempre é feita uma calibração, que é fundamental para garantir que as medições obtidas no aparelho sejam precisas. Esta calibração pode variar em vários espectrofotômetros. A maioria dos fabricantes fornece um guia sobre como calibrar o aparelho.
É muito importante ao colocar a amostra a ser analisada, não tocar no tubo de ensaio na parte do meio, para evitar manchas de dedo que alteram a leitura do aparelho. Assim, o ideal é pegar na parte superior do tubo e colocá-lo no aparelho para que ele faça a leitura e dê o resultado almejado. Além disto, para que um espectrofotômetro funcione corretamente, deve ser aquecido antes de usar. Muitos dispositivos demoram cerca de 10 minutos para aquecer.

Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador.

Os espectrofotômetros são instrumentos de análise que permitem:

• Selecionar o comprimento de onda (lâmbda) da radiação adequado à análise de um determinado componente
• Medir a intensidade I do feixe emergente que corresponde a um determinado feixe incidente Io, convertendo o sinal recebido no detector em medida de Absorvância para o comprimento de onda da análise. Em outras palavras, criar o "Branco" e em seguida fazer as medidas com a amostra.
• Determinar a concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico da variação de absorvância (ou transmitância) em função da concentração de várias soluções-padrão.

Natureza da Cor e Absorção de Luz

O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. A maioria dos métodos utilizados em bioquímica clínica envolve a determinação espectrofotométrica de compostos corados (cromóforo) obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente (reagente cromogênico), originando um produto colorido. Os métodos que se baseiam nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais geralmente são específicos e muito sensíveis. A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se ao fato de eles absorverem luz visível (região visível do espectro eletromagnético).

A espectrofotometria — medida de absorção ou transmissão de luz — é uma das mais valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem como em análises clínicas. Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível, ou infravermelho.

Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes e da espessura da solução – caminho óptico (veja Figura 1.1).

A intensidade da cor de uma solução é proporcional à concentração das moléculas absorventes de luz. Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Por outro lado, a cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida (Veja a Figura 1.2).

Concluindo, uma solução aparece como branca porque transmite luzes de todas as cores; quando absorve luzes de todas as cores, a solução é preta. Finalmente, a solução é verde quando absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul), a qual é denominada luz complementar. A Tabela 1.1 relaciona a cor da luz com a cor da luz complementar. 

Tabela 1.1 Comprimento de ondas de diversas cores.

 Quando recebemos raios de luz de diferentes frequências podemos perceber cores diferentes destas, como combinações. A luz branca que percebemos vinda do Sol, por exemplo, é a combinação de todas as sete cores do espectro visível.

Absorção de Luz

A luz é urna forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton). O movimento ondulatório é caracterizado pelo comprimento de onda (), o qual corresponde à distância linear entre duas cristas, medido em nanômetros (nm), que corresponde a 10^-9 m .

O conteúdo energético da luz é inversamente proporcional ao comprimento de onda, de tal forma que a luz violeta de = 380 nm é bem mais energética do que a luz vermelha de = 700 nm. Dentro do exposto podemos dizer que a luz é constituída de partículas de energia denominadas fótons, em que o conteúdo energético está intimamente relacionado com o comprimento de onda. A absorção de luz pela matéria envolve a incorporação da energia contida no fóton à estrutura das moléculas absorventes.

Quando isso acontece, as moléculas absorventes passam do estado fundamental (estado energético mais baixo) para o estado excitado (estado energético mais alto).

Contudo, a duração do estado excitado normalmente é breve, e a molécula retorna ao estado fundamental após aproximadamente 10^-8 segundos. Geralmente, o retorno ao estado fundamental libera energia na forma de calor. Portanto, quando um feixe de luz monocromática (1 comprimento de onda) atravessa uma solução que contém moléculas absorventes, parte das ondas eletromagnéticas seriam absorvidas pelas moléculas presentes na solução, assumindo o estado excitado, as quais retornariam a seguir ao estado fundamental, liberando a energia na forma de calor (veja Figura 1.3).

Figura 1.3 Onda eletromagnética. 

O fenômeno de absorção implica que o conteúdo energético do fóton seja igual à quantidade de energia necessária para que a molécula ou átomo passe do estado fundamental para o excitado. Quando o conteúdo energético do fóton for maior ou menor do que a quantidade de energia necessária para o composto passar do estado fundamental para o excitado, o fenômeno de absorção não ocorre.

Assim, deve-se utilizar um feixe de luz monocromática de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado, nos métodos de dosagem colorimétrica. O procedimento para escolha do melhor comprimento de onda é simples e consiste em submeter uma solução a feixes de luzes monocromáticas de diferentes comprimentos de onda e verificar qual deles é mais absorvido pela solução.

Fonte:

http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/naturezadacor.html
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/index.html
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/absorcaodacor.html